纯钛种植体表面处理对人牙龈成纤维细胞粘附增殖的影响

种植义齿  

种植义齿是一种舒适度好、美观度高，且不需对邻牙造成磨损，适用范围极广的口腔修复方式，为多数全牙列缺失或者局部牙缺失的患者所接受。在牙列缺失患者的临床治疗中，种植体维持长期稳定的基础需要良好的骨结合同时种植体颈部形成良好的“袖口”状软组织封闭。对纯钛种植体表面进行处理，同时促使种植体周软硬组织结合是最近几年口腔种植学的主要研究方向。 

本研究主要从种植体－软组织的界面特征及生物学宽度展开分析，并阐述当前常用的几种纯钛种植体表面处理方法，探讨其在人牙龈成纤维细胞黏附和增殖过程中所起到的影响。  
 

一、种植体－软组织的界面特征 
纯钛种植体在软组织结构上和天然牙牙周软组织较为类似，界面上厚的角化上皮能够起到有效保护牙周组织的作用，同时邻近部分的沟内上皮也可以在一定程度上为龈沟内细胞提供保护作用，且半桥粒所连上皮也能够有效缓冲外力。但是纯钛种植体软组织界面和天然牙的差异主要在于种植体表面的胶原纤维是呈环形包绕种植体，而且因为种植体表面无牙骨质存在，纤维结缔组织不能垂直或者斜向插入（其对应插入部位为牙骨质、牙槽骨）。 



这种排列方式让种植体周软组织的封闭作用差于天然牙，在受到毒素和机械刺激之后，易和周边牙龈纤维发生分离，因此难以阻碍结缔组织附着降低以及抵抗细菌侵袭。同时，种植体周的内层组织中，牙龈成纤维细胞及血管的含量少，导致炎症防御力弱。种植体周的纤维结缔组织是一种类似“瘢痕”样的结构，由人牙龈成纤维细胞及其分泌的胶原纤维组成。一共分两个部分，上部为结合上皮下方含丰富成纤维细胞的Ⅲ型胶原纤维，下部与种植体紧密结合的成纤维细胞较少，细胞外基质由大并且密集的厚型Ⅰ型胶原纤维组成，这可能对界面的稳定和机械抵抗力有所帮助。 

现在比较火热的平台转移是指在二段式种植-修复中所选用的基台直径需比种植体平台更小，并且通过利用两部件错配的方法，使得软组织紧紧包围种植体同时在其顶部位置产生1个宽度较大、抵抗能力较强的“袖口”，从而得到稳定的界面，但是平台转移距离对种植体的影响存在争论。  


二、种植体-软组织的生物学宽度 
种植体具有宽度一般约2mm的生物学宽度（biological width），与天然牙类似，其中结合上皮以及牙槽嵴顶上方结缔组织组成的类似“袖口”的软组织封闭，起到抵抗毒素、菌斑以及异物等入侵的作用。Todescan等的研究中，将种植体分别置于犬下颌骨牙槽嵴龈方1mm、平齐牙槽嵴顶及牙槽嵴顶根方1mm，检测结合上皮的生物学宽度分别为1.67mm、1.93mm与2.78mm；而检测的结缔组织宽度则分别为1.13mm、0.92mm及1.60mm。  

 

Siqueira等评估了2种不同植入深度的共55枚种植体，发现2种植入深度的种植体都表现出相似的牙槽骨损失，且对软组织的衰退没有影响。但是Negri等认为种植体周软组织发生的改变可能与硬组织的重塑有关，植体的植入位置越深，垂直性骨吸收的风险也越大，尽管植入更深的测试组和骨水平的对照组获得的种植体周软组织的尺寸相似，但是可能会对美学产生有害结果。但是软组织的评估需要更长的时间确认，并且在愈合期间需要更大的样本，以确保种植体位置周围的牙槽骨和软组织的位置保持稳定。  

 
三、不同纯钛种植体表面处理 
纯钛种植体表面处理所得到的表面形貌对人牙龈成纤维细胞的形态、粘附及增殖有密切的关系。主要通过物理机械、化学、生物涂层等对纯钛表面进行处理，从而获得合适的表面形貌。 

3.1物理机械方法 
①表面机械研磨（surface mechanical attrition treatment，SMAT）：将纯钛样品在不同的持续时间下进行表面机械研磨（SMAT），以改善表面性能并产生超细晶粒层，改善了磨损性能，且SMAT后的表面粗糙度增加了近6倍，是因为在其表面撞击形成谷和峰。 

②表面轧制技术（surface mechanical attrition treatment，SRT）：Wang等运用SRT在纯钛中产生约800μm梯度的微观结构，通过光学显微镜、透射电子显微镜和电子背射衍射分析不同深度的微观结构特征，并且通过拉伸试验表明SRT后的钛样品显示出更高的强度。然后通过喷砂、大砂砾、酸蚀（sand-blasted，large grit，acid-etched，SLA）从而获得微/纳米结构的表面形貌，得到不同的粗糙度以及微孔隙。也有通过不同激光参数处理获得微观结构特征。

 


3.2化学处理 
可以通过阳极氧化或者阴极极化得到复杂的纳米形貌，也可以通过碱化学和热处理钛表面。Komasa通过NaOH处理在钛表面制造钛纳米片（titanium nanosheets，TNS），然后在600℃下进行热处理来稳定TNS，通过SEM图像证明TNS改性的表面具有良好的粗糙度且没有裂缝。其表面在微米级别下看起来可能是光滑的，但在纳米级别下观察具有相当大的粗糙度，复杂的形貌能让细胞更好的粘附。 

3.3生物涂层 
是在种植体表面涂覆具有生物活性的材料使钛表面具有更好的生物相容性。Brunello等通过体外研究比较4种不同表面（未涂覆的Ti6Al4V、阳极氧化处理、涂覆氮化钛和涂覆氮化锆）的生物相容性和抗菌活性，使用高分辨率系统研究表面形貌以及测量表面粗糙度，使用MTT、SEM、免疫荧光和实时PCR分析人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）的粘附和增殖，从口腔分离的5种常见菌群测试抗菌活性，通过溶血和污染物致突变性（AMES）检测生物相容性，证明所有表面都可以安全的作为种植基台，但是涂覆氮化锆的钛表面表现出更好的细胞生物相容性，并表现出对5种不同细菌更大的抗菌活性。现在也有学者进行2种或2种以上的方法处理纯钛表面，通过结合2种或2种以上方法的优点，使其机械性能和生物相容性获得提升。 

四、纯钛表面各种处理方式 
对组织生物学的影响 
纯钛种植体表层的微沟纹、微孔以及微管等结构特征会对组织的生物学特性产生不同影响。当前研究中发现，种植体表面比较粗糙则会使其表面与细胞的接触面积增加，且增大纯钛种植体表面积也能够有效提升其嵌合力。同时，对于种植体表面上骨组织细胞的生长也会起到一定的积极影响。种植体-软组织两者之间的粘附同时需要结合上皮半桥粒连接和牙龈纤维附着，从而达到紧密结合。上皮细胞通过细胞外基质的分泌，并于细胞膜及钛表面上产生一层半桥粒-基板的结构，从而实现有效附着。而人牙龈成纤维细胞是以粘着斑的形式进行粘附，从而确保细胞外基质粘附在种植体表层。分析纯钛表面对上皮细胞和成纤维细胞附着和增殖影响的相关研究可知，有人提出纯钛种植体表层较为粗糙的形貌，有利于软-硬组织界面之间相互接触，还能加快细胞分化速度。 

Lauer等通过实验得出，在经过抛光的钛表面上，上皮细胞的粘附效果最佳；但体外实验表明，牙龈成纤维细胞在较粗糙的表面比光滑表面表现出了更高数量的焦点接触、更有条理的细胞骨架和更强力的肌动蛋白纤维网络。 

 


Guida等使钛在室温下通过20V的电压，并在1mol/L硫酸和0.15%体积分数的氢氟酸水溶液中进行阳极氧化24h来生产测试样品，未氧化为对照组。收集培养6h，48h和7d后2个组的HGFs，并使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测并定量释放的Ⅰ型胶原的量，发现当随时间评估Ⅰ型胶原蛋白产生的量时，在阳极氧化处理后的钛片上生长的HGFs与对照组表面上生长的HGFs相比显示合成更高的蛋白质量，且在第7天达到显著差异。实验表明，通过阳极氧化获得纳米结构的钛植入物表面明显刺激了牙龈成纤维细胞的功能。 

Shi等使用气体氮制备氮化钛（TiN）涂层，然后在CaCl2溶液中阳极氧化，再行水热处理得到测试钛片，对照组只制备TiN涂层。将细胞以每孔4×104个细胞的密度接种到24孔板中的样品上，在培养3h时和24h后评估初始细胞附着，细胞以每孔1×104个细胞的密度接种到24孔板中的样品上并培养3h，使用SEM观察细胞形态，细胞以每孔1×104个细胞的密度接种到24孔板中的样品上，在培养2，4和6d后进行阿尔玛蓝（Alamar Blue）测定来研究细胞增殖。  

在水热处理过的TiN涂层的钛表面生长的细胞表现均好于对照组。Ca改性的Ti表面增强了成纤维细胞的附着力，促进了束状肌动蛋白丝的发展。他们假设随着Ca掺入Ti表面，Ca结合细胞外基质蛋白，介导细胞的附着和扩散的能力获得增强。水热法将Ca结合到TiN表面上也可以增强外基质蛋白的吸附，因为纤维连接蛋白和纤维蛋白都在实验组的培养基中以高水平供应。 


五、纯钛表面各种处理方法 
对人牙龈成纤维细胞形态影响 
人牙龈成纤维细胞的粘附力及活性均和细胞形态、外基质分泌存在密切相关性。对于细胞胞体相对丰满且伸展性能良好的部分细胞，其附着能力也相对较强，其分泌的外基质也有助于细胞增殖过程，提升细胞本身粘附力。 

刘潇等在研究中发现，各种纯钛表层处理方法都会对人牙龈成纤维细胞的形态与分布产生一定影响。纯钛表面分别经过TiO2喷砂结合应用HCl/H2SO4双重酸蚀处理、Al2O3喷砂结合应用HCl/H2SO4双重酸蚀处理后，接种的细胞均相对较为密集，同时表层粘附的细胞胞体相对较为丰满并具有较好的伸展性能，其伸出的伪足个数也相对较多，各细胞的伪足相互交织，并形成网状，从而发挥固定效果，此外粗糙的表层也均充满细胞外基质；相比之下，在光滑的纯钛表面上的细胞则较为稀疏，同时表面细胞的伸展性能相比于其他2种粗糙处理方法的伸展性能要差。 

 


陈静等认为纯钛表面粗糙度不会对细胞附着的数量产生影响，但细胞的形状会发生变化。当粗糙度升至0.281μm时，细胞形状趋于扁圆，扁圆形的成纤维细胞与长梭形的成纤维细胞相比，与材料表面局部接触减少，附着能力降低，当纯钛表面粗糙度Ra≤0.169μm时，人牙龈成纤维细胞具有更好的粘附能力。Ferrà-Canellas等使用含氟化物的有机电解质通过电化学氧化在钛表面制备48nm和74nm两种不同直径的TiO2纳米多孔基团，将HGFs接种在2个样品上，分析代谢活性、细胞毒性、细胞粘附和基因表达。通过扫描电子显微镜，原子力显微镜观察细胞形态，发现在74nm范围内的纳米多孔基团，能够更好的诱导HGF长入孔隙中。 

Kearns将钛片分为表面涂有未经处理的聚四氟乙烯（PTFE）纳米纤维涂层组、表面涂有等离子处理过的PTFE纳米纤维组和未处理组，使用天狼星红（picro-siriusred）染色技术来检测胶原蛋白。细胞分别在3组材料上培养7d，在未涂布的基材上的细胞随机取向，细胞内和细胞外的胶原蛋白沿极化方向排列，没有整体取向。而未经处理的纤维涂层组和涂有等离子处理过的纤维涂层组的细胞沿纤维涂层方向排列，细胞分泌的胶原蛋白也与纤维涂层方向一致。当细胞与纤维涂层加工痕迹对齐时，胶原蛋白也是如此。28d后观察到更厚、更广泛分布的胶原蛋白纤维网络。研究显示，牙龈成纤维细胞在涂有PTEE的纯钛上优先排列成PTEE纳米纤维图案，形成细长的细胞，尽管跨越各种纤维，仍保持纵向对齐。 


六、纯钛表面各种处理方法 
对人牙龈成纤维细胞的增殖活性影响 
在当前探究中，不少学者认为纯钛表面形貌对人牙龈成纤维细胞增殖方面也存在着一定的影响效果。数据显示，纯钛表面微观形貌调节体外细胞反应和HGFs的表型表达，蚀刻表面可以促进细胞增殖，改善HGFs的生物学行为。 

在Baltriukiene的研究中，比较了6种不同的Ti处理（4种不同图案的脉冲激光、喷砂和抛光）对HGFs粘附、增殖以及FAK表达和磷酸化能力的影响。在培养24h后，用SEM观察到激光处理表面上的细胞粘附强于未处理组。通过MTT测定培养24、48、72h后测定HGFs的增殖，观察到72h后（P=0.037）Ti表面之间细胞增殖有统计学差异，表明激光修饰的Ti表面对HGFs增殖具有不同的作用。  

孟维艳采用机械加工（M），电化学腐蚀（ECE），电化学腐蚀加酸蚀（ECA）在纯钛金属试件表面形成3种不同的表面形貌，细胞培养24小时后测3组的细胞分离率，M组表面的细胞分离率（66.26±4.0771）明显高于ECA组（43.50±0.6557）和ECE组（53.70±1.2897）（P＜0.05），ECA组（43.50±0.6557）明显低于ECE组（53.70±1.2897）（P＜0.05）。说明ECA组的纯钛表面兼具微米、纳米微结构的均匀表面有利于人牙龈成纤维细胞的粘附。 

Xing等通过3种酸（草酸OA/酒石酸TA/乙酸AA）处理钛片，并在3种不同的恒定电流密度（1mA/cm2，5mA/cm2和15mA/cm2）下进行3个时间段的极化（0.5h、2h和5h），抛光钛片（po）作对照组。抛光Ti表面形貌和化学性质被有机酸中的阴极极化改变，受电解质、电流密度和极化时间的影响。乙酸实现最高的氢化物量，而草酸导致最复杂的表面形貌。随着电流密度从1mA/cm2到15mA/cm2，钛表面氢化物量先增加然后减小。表面复杂性和氢化物形成均随极化时间增加而增加。细胞接种第1、3和6天测量细胞增殖率，发现不同样品上的细胞在第1天表现出相似的增殖速率。然而在第3天，OA，TA和AA组上的细胞比对照组上的细胞生长更快。AA组的增殖率明显高于对照组。在第6天，OA和AA上的细胞增殖率下降，而TA和对照组上的细胞增加。说明钛表面的阴极极化通过氢化物促进HGFs增殖。 

Wang的研究中，在光滑组和SLA处理组加入釉质基质衍生物（EMD），通过DAPI染色细胞核及CCK8进行细胞计数和细胞增殖的测定，EMD对光滑表面培养2、4、8和24h后以及SLA表面培养4、8和24h后的细胞扩散有显著的作用。此外，对于含有EMD的组，光滑表面上5天后和SLA表面上3天和5天后的细胞增殖也明显增加。认为EMD的使用可通过促进牙龈成纤维细胞附着、增殖和Ⅰ型胶原蛋白的基质合成来加速牙种植体周围软组织整合。 

Yang将数量为5×104个/孔的HGFs接种于聚多巴胺涂层的钛表面和未涂层的钛表面上，分别培养1、3、5、7d，使用CCK-8测定法，光密度分析450nm处的吸光度（OD）值，通过OD值确定HGFs的增殖。通过DAPI荧光染色检测HGFs在不同样品上（1、4、24h）的细胞粘附。在培养期间，聚多巴胺涂层的钛表面上HGFs数量随时间依赖性增加，对于所有时间点，聚多巴胺涂层的钛表面细胞数远远超过未涂层的钛表面。结果表明，聚多巴胺修饰的碱热钛表面是HGFs粘附、扩散和增殖的优良基质。  


七、展望 
纯钛种植体本身不具有抗菌活性，因此，通过对纯钛种植体表面进行有效的处理，可使其表面产生良好的生物学封闭，阻止细菌粘附，从而维持种植体在体内的长期稳定性。对于纯钛种植体表面处理的方法研究还需结合种植体-软组织的界面特征以及生物学宽度、生物学活性等特点展开，并通过材料试验与临床试验进行验证。 


来源：林炯,黎红.纯钛种植体表面处理对人牙龈成纤维细胞粘附增殖的影响[J].口腔医学,2019,39(12):1135-1139. 
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